انواع روش های کروماتوگرافی
لطفا برای بهتر شدن شرایط داروسازی کشور و بهبود سلامت عمومی ایران در نظر سنجی زیر شرکت کنید.
انواع کروماتوگرافی
∞ کروماتوگرافی مایع – جامد
∞ کروماتوگرافی جذب سطحی
∞ کروماتوگرافی لایه نازک
∞ کروماتوگرافی تبادل یونی
∞ کروماتوگرافی ژلی
∞ کروماتوگرافی گاز – جامد
∞ کروماتوگرافی مایع – مایع
∞ کروماتوگرافی تقسیمی
∞ کروماتوگرافی کاغذی
∞ کروماتوگرافی گاز- مایع
∞ کروماتوگرافی گاز – مایع
∞ کروماتوگرافی ستون مویین
∞ مزیت روشهای کروماتوگرافی
با روشهای کروماتوگرافی میتوان جداسازی‌هایی را که به روشهای دیگر خیلی مشکل می‌باشند انجام داد. زیرا اختلافات جزئی موجود در رفتار جزئی اجسام در جریان عبور آنها از یک سیستم کروماتوگرافی چندین برابر میشود. هر قدر این اختلاف بیشتر شود قدرت جداسازی مواد بیشتر و برای انجام جداسازی مواد نیاز کمتری به وجود اختلافات دیگر خواهد بود.
مزیت کروماتوگرافی نسبت به ستون تقطیر این است که نسبتا آسان میتوان به آن دست یافت با وجود اینکه ممکن است چندین روز طول بکشد تا یک ستون تقطیر به حداکثر بازده خود برسد ولی یک جداسازی مواد کروماتوگرافی می‌تواند در عرض چند دقیقه یا چند ساعت انجام گیرد.
یکی از مزایای برجسته روشهای کروماتوگرافی این است که آنها آرام هستند. به این معنی که احتمال تجزیه مواد جداشونده به وسیله این روش‌ها در مقایسه با سایر روش‌ها کمتر است.
مزیت دیگر روشهای کروماتوگرافی در این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است به این دلیل روشهای تجزیه‌ای مربوط به جداسازی مواد کروماتوگرافی میتوانند در مقیاس میکرو و نیمه میکرو انجام گیرند.
روشهای کروماتوگرافی ساده سریع و وسایل مورد لزوم آنها ارزان هستند. مخلوط‌های پیچیده را میتوان نسبتا به آسانی به وسیله این روش‌ها به دست آورد.
انتخاب بهترین روش کروماتوگرافی
انتخاب نوع روش کروماتوگرافی بجز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافی گازی در جداسازی مواد گازها) عموما تجربی است. زیرا هنوز هیچ راهی جهت پیش بینی بهترین روش برای جداسازی مواد اجسام مگر در چند مورد ساده وجود ندارد. در ابتدا روشهای ساده‌تر مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان میشوند. زیرا این روش‌ها در صورتی که مستقیما قادر به جداسازی مواد نباشند نوع سیستم کروماتوگرافی را که جداسازی مواد بوسیله آن باید صورت بگیرد، مشخص میکنند آنگاه در صورت لزوم از روشهای پیچیده‌تر استفاده میشود. از فهرست زیر میتوان به عنوان یک راهنمای تقریبی استفاده کرد.
در جداسازی‌های مشکل وقتی که روشهای ساده فاقد کارایی لازم هستند روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HELC) می تواند جوابگو باشد.
روش‌ها
روشهای سوانگاری را میتوان ابتدا بر حسب ماهیت فاز متحرک و سپس بر حسب ماهیت فاز ساکن طبقه‌بندی کرد. فاز متحرک ممکن است گاز یا مایع و فاز ساکن ممکن است جامد یا مایع باشد. بدین ترتیب فرایند کروماتوگرافی به چهار بخش اصلی تقسیم میشود. اگر فاز ساکن جامد باشد کروماتوگرافی را کروماتوگرافی جذب سطحی و اگر فاز ساکن، مایع باشد کروماتوگرافی را تقسیمی می‌نامند.
کروماتوگرافی لایه نازک
این نوع جداسازی برای مقادیر بسیار کم کاربرد دارد. در این کروماتوگرافی فاز ساکن جامد و فاز متحرک مایع می‌باشد. حلال توسط جذب سطحی روی لایه بالا می‌رود و اجزای مختلف نمونه برحسب نوع و استحکام پیوند در محلی از لایه متمرکز میشوند. معمولاً اجسام قطبی پایین‌تر و اجسام غیرقطبی در بالای لایه قرار می‌گیرند. حلال مناسب باید لکه‌ها را به خوبی از هم جدا کند و با مواد موجود در نمونه واکنش ندهد. لکه گذاری روی لایه نازک به وسیله لوله مویین انجام میشود. طبقه جاذب یا فاز ساکن (سیلیکاژل، آلومین ...) روی شیشه یا هر جسم دیگری که خود اثری در عمل ندارد ریخته میشود.
کروماتوگرافی ژلی
این روش کروماتوگرافی مولکول ها را بر اساس تفاوت در اندازه شان تفکیک می کند. در این روش مولکول مورد نظر در فاز متحرک حل می شود و از درون فاز ثابت عبور میکند . در این روش کروماتوگرافی اتصال بین مولکول مورد نظر و فاز متحرک اتفاق نخواهد افتاد و تنها مولکول ها بر اساس اندازه شان از همدیگر جدا می شوند.
مزیت روشهای سوانگاری
با روشهای کروماتوگرافی میتوان جداسازی‌هایی را که به روشهای دیگر خیلی مشکل می‌باشند انجام داد. زیرا اختلافات جزئی موجود در رفتار جزئی اجسام در جریان عبور آنها از یک سامانه کروماتوگرافی چندین برابر میشود. هر قدر این اختلاف بیشتر شود قدرت جداسازی مواد بیشتر و برای انجام جداسازی مواد نیاز کمتری به وجود اختلافات دیگر خواهد بود.
مزیت کروماتوگرافی نسبت به ستون تقطیر این است که نسبتاً آسان میتوان به آن دست یافت با وجود اینکه ممکن است چندین روز طول بکشد تا یک ستون تقطیر به حداکثر بازده خود برسد ولی یک جداسازی مواد کروماتوگرافی می‌تواند در عرض چند دقیقه یا چند ساعت انجام گیرد.
یکی از مزایای برجسته روشهای کروماتوگرافی این است که آنها ملایم هستند. به این معنی که احتمال تجزیه مواد جداشونده به وسیله این روش‌ها در مقایسه با سایر روش‌ها کمتر است.
مزیت دیگر روشهای کروماتوگرافی در این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است به این دلیل روشهای تجزیه‌ای مربوط به جداسازی مواد کروماتوگرافی میتوانند در مقیاس میکرو و نیمه میکرو انجام گیرند.
روشهای کروماتوگرافی ساده سریع و وسایل مورد لزوم آنها ارزان هستند. مخلوط‌های پیچیده را میتوان نسبتاً به آسانی به وسیله این روش‌ها به دست‌آورد.
مواد نوع کروماتوگرافی مواد شیمیایی مشابه کروماتوگرافی تقسیمی مواد شیمیایی غیر مشابه کروماتوگرافی جذب سطحی گازها و اجسام فرار کروماتوگرافی گازی مواد یونی و معدنی
کروماتوگرافی تبادل یونی در ستون کروماتوگرافی کاغذی یا لایه نازک الکترفورز ناحیه‌ای مواد یونی و غیر یونی کروماتوگرافی تبادل یون یا ژلی مواد زیستی و ترکیباتی با جرم مولکولی نسبی بالا کروماتوگرافی ژلی الکتروفورز
انتخاب بهترین روش کروماتوگرافی
انتخاب نوع روش کروماتوگرافی بجز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافی گازی در جداسازی مواد گازها) عموماً تجربی است. زیرا هنوز هیچ راهی جهت پیش بینی بهترین روش برای جداسازی مواد اجسام مگر در چند مورد ساده وجود ندارد. در ابتدا روشهای ساده‌تر مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان میشوند. زیرا این روش‌ها در صورتی که مستقیماً قادر به جداسازی مواد نباشند نوع سیستم کروماتوگرافی را که جداسازی مواد بوسیله آن باید صورت بگیرد، مشخص میکنند آنگاه در صورت لزوم از روشهای پیچیده‌تر استفاده میشود. از فهرست زیر میتوان به عنوان یک راهنمای تقریبی استفاده کرد:
در جداسازی‌های مشکل وقتی که روشهای ساده فاقد کارایی لازم هستند روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) می‌تواند جوابگو باشد.
اثرهایی که باعث جذب سطحی میشوند همان اثرهایی هستند که موجب جذب در مولکولها میشوند. این اثرها عبارتند از: جاذبه الکترواستاتیکی، ایجاد کمپلکس، پیوند هیدروژنی، نیروی واندروالس و غیره. اما در مورد اجسام بیرنگ نمیتوان تغییرات را مستقیما مشاهده کرد. با این حال بسیاری از اجسام در هنگام تابش نور ماورای بنفش فلوئورسانس پیدا میکنند و در چنین مواردی از این خاصیت جهت مشاهده باندها استفاده میشود. تعدادی از جاذبهای جامدی که عموما مصرف میشوند عبارتند از: آلومینا، سیلیکاژل، فلورسین، زغال چوب، منیزیم اکسید، کلسیم کربنات، نشاسته و شکر. معمولا شیمیدانهای آلی از آلومینا، سیلیکاژل و فلورسین بیشتر استفاده میکنند. در کروماتو گرافی لایه نازک حلال به دلیل وجود فشار اسمزی (osmotic pressure) شروع به بالارفتن می کند. در کروماتو گرافی کاغذی حلال از طریق الیاف کاغذ در نتیجه عمل موئینگی نفوذ میکند.
کروماتوگرافی مایع – جامد (LSC)
در این روش جدا شدن بر اساس جذب سطحی یا تشکیل کمپلکس است. کروماتوگرافی LSC در واقع نوعی کروماتوموگرافی جذبی است که مواد بر اساس اختلاف در قابلیت جذب خود روی سطح جامد از یکدیگر جدا میشوند. این روش نیز به انواع مختلفی چون کروماتوگرافی جذب سطحی (برای جداکردن مواد شیمیایی غیر مشابه) ، کروماتوگرافی لایه نازک، کروماتوگرافی تبادل یونی و کروماتوگرافی ژلی تقسیم میشود.
کروماتوگرافی گاز – جامد (GSC)
در این روش نیز اساس جداسازی جذب سطحی فاز گاز روی سطح جامد است که برای خالص سازی گازها اجسام فرار استفاده میشود.
کروماتوگرافی مایع – مایع (LLC)
به دو گونه تقسیمی (برای جدا کردن مواد شیمیایی مشابه) و کاغذی استفاده می شود.
کروماتوگرافی گاز- مایع (GLC )
کروماتوگرافی ستون مویین از این نوع است. در LLC و GLC ، مواد بر اساس توزیع بین دو فاز جدا میشوند. برای انتخاب نوع روش کروماتوگرافی ابتدا روشهای ساده‌تر مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان می شوند و اگر پاسخ گو نباشد به سراغ روشهای پیچیده‌تر مانند روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HELC) می‌رویم.
حال به توضیح برخی روش های کروماتوگرافی می پردازیم:
کروماتوگرافی جذب سطحی
در این نوع کروماتوگرافی جداسازی بر مبنای تقاوت در جذب سطحی اجزای فاز متحرک و فاز ساکن صورت می‌گیرد. در کروماتوگرافی جذب سطحی، فاز متحرک مایع (حلالی مانند هگزان) و فاز ساکن جامد (مانند آلومین یا سیلیکاژل) است بنابراین نوع خاصی از کروماتوگرافی مایع – جامد محسوب میشود.
در این نوع جداسازی حلال(فاز متحرک) با عبور خود از میان ستون جامد (فاز ساکن) اجزای مخلوط را با خود حمل میکند. سرعت حرکت هر جزء ، به میزان جذب سطحی آن بر روی ماده داخل ستون بستگی دارد. به این ترتیب سرعت ماده‌ای که کم جذب شده است بیشتر از ماده‌ای که زیاد جذب شده است خواهد بود و اجزایی که قابلیت جذب بالاتری دارند، در قسمت بالای ستون و اجسامی که قابلیت جذب کمتر دارند در قسمت‌های پایین ستون ، جذب خواهند شد. حال اگر اختلاف بین جذب‌های سطحی به حد کافی زیاد باشد، جداسازی مواد کامل انجام خواهد گرفت..
کروماتوگرافی لایه نازک(TLC)
این نوع کروماتوگرافی نمونه ای از کروماتوگرافی جذب سطحی است که در آن، به جای اینکه ستون از جاذب(فاز ساکن) پر شود، آن را به صورت لایه نازک روی یک صفحه شیشه‌ای یا لایه پلاستیکی یا ورقه فلزی قرار میدهند. سایر اصول جداسازی مانند روش کروماتوگرافی جذب سطحی است.
کروماتوگرافی تبادل یونی
در این روش بین فاز متحرک (محلول) و فاز ساکن (جامد) به صورت برگشت پذیر یون مبادله میشود. جامد تشکیل‌دهنده فاز ساکن رزین نامیده میشود و پایداری مکانیکی و شیمیایی و یکنواختی اندازه ذرات از خصوصیات آنها است. قالب این رزین‌ها بر پایه یک بسپار بزرگ (معمولا پلی استیرن) استوار است اما برخی از آن ها متکی بر اسید متا اکریلیک هستند، رزین‌ها به دو نوع تعویض کننده آنیونی و کاتیونی تقسیم می شوند. هر کدام از این تعویض کننده‌ها به نوع بازی ضعیف و قوی و اسیدی ضعیف و قوی تقسیم میشوند. میتوان این روش را مانند کروماتوگرافی جذبی در نظر گرفت به گونه ای که رزین‌ها جایگزین جاذب شده باشند. رزین‌ها باید دارای گروه‌های مبادله کننده تک عاملی باشند و درجه اتصالات عرضی کنترل شده داشته باشند. گستره اندازه ذرات نیز باید تا آنجا که ممکن است کوچک باشد. با این روش کروماتوگرافی میتوان محلول‌های رقیق را به خوبی جداسازی کرد.
کروماتوگرافی ژلی
این نوع کروماتوگرافی برای اولین بار در سال 1954 معرفی و در سال 1959 اصلاح شد. در این روش جداسازی‌های مبتنی بر الک کردن مولکولی بر روی اجسام بی‌بار در جریان مهاجرت الکترو اسمزی از داخل ژل‌ها انجام میشود. بدین ترتیب که جداسازی بر مبنای اندازه‌های نسبی مولکول ها انجام شده و از اصطلاح صاف کردن به وسیله ژل استفاده میشود. ژل استفاده شده در این روش باید بی اثر و پایدار باشد. فاز ساکن از یک قالب متخلخل تشکیل شده که منفذهای آن به وسیله حلالی که فاز متحرک را تشکیل داده پر شده است. از آنجا که اساس جداسازی بر این است که مولکول‌های بزرگ تر از حد وارد سوراخ‌ها نشده و به ترتیب جرم مولکولی از ستون خارج شوند و مولکول‌های کوچک تر بر حسب شدت نفوذشان سوراخ ها را پر کنند پس اندازه سوراخ بسیار مهم است. همچنین گرانروی نمونه نیز اهمیت زیادی دارد و نباید از دو برابر گرانروی شوینده بیشتر باشد. از دیگر عوامل مهم حجم نمونه است بدین ترتیب که هر چه حجم نمونه کمتر باشد، غلظت هر جزء در محلول خارج شده نیز کمتر خواهد بود.
کروماتوگرافی تقسیمی
در این روش که نمونه‌ای از کروماتوگرافی مایع- مایع است، شیوه کار بسیار شبیه به کروماتوگرافی جذب سطحی است و تفاوت این دو روش در ماهیت ماده پر شده در ستون است. همچنین حجم ظرفیت یک ستون تقسیمی، غالبا کوچک تر از ظرفیت یک ستون جذب سطحی بوده و گاهی این اختلاف خیلی زیاد است. فاز ثابت لایه ای از محلول است که روی سطح جامد ناصافی مانند سیلیکاژل قرار دارد و فاز متحرک مایعی غیر محلول در مایع اولی است. سرعت حرکت یک جزء از مخلوط تابع انحلال پذیری آن در فاز ساکن است یعنی جدا شدن اجزا بدین صورت است که اجسامی که بیشتر حل میشوند، کندتر از اجسامی که کمتر حل میشوند به طرف پایین ستون حرکت میکنند. در جریان عبور از ستون ، اجسام میان دو فاز تقسیم شده و جداسازی انجام میشود. در این روش ابتدا مخلوط اجسام به صورت یک نوار در ستون در می‌آید که علت آن جذب سطحی یا جذب به وسیله فاز ساکن است.
کروماتوگرافی کاغذی
کروماتوگرافی کاغذی نوع خاصی از کروماتوگرافی تقسیمی است که در آن صفحات کاغذی جای ستون پر شده را می‌گیرند. در این روش فاز ساکن کاغذ است. مولکول‌های سلولز نیز به نوبه خود به وسیله ساختار الیافی کاغذ در وضعیت‌های ثابت نگه داشته میشود. در ابتدا کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی مخلوط‌های مواد آلی به کار می رفت. اما امروزه برای جداسازی یون‌‌های معدنی استفاده میشود. به وسیله این روش هم آنیون‌ها و هم کاتیون‌ها را میتوان جداسازی کرد.
برای انجام این روش قطره‌ای از محلول حاوی مخلوطی که باید جدا شود را روی یک صفحه یا نوار کاغذ صافی در محل علامت گذاری شده قرار میدهند. قطره به صورت یک لکه حلقوی در این محل پخش میشود. هنگامی که لکه خشک شده کاغذ را در یک ظرف مناسب سربسته طوری قرار میدهند که یک سر آن در حلال انتخاب شده به عنوان فاز متحرک فرو رود، حلال از طریق الیاف کاغذ در نتیجه عمل موئینگی نفوذ میکند. پس از گذشت زمان از قبل تعیین شده، وقتی حلال مسافت مناسبی را طی کرد، کاغذ را بیرون آورده و حلال را با علامتی مشخص میکنند. پس از خشک شدن صفحه وقتی محل های مناطق جدا شده آشکار شدند هر یک از اجسام به طور جداگانه شناسایی میشوند. در موارد ایده‌آل ، هر جسم با واکنش گر مکان یاب ، رنگ مخصوصی می‌دهد که در مورد مواد معدنی بیشتر و درمورد مواد آلی کمتر مشاهده میشود. ساده‌ترین روش شناسایی بر اساس مقدار Rf یعنی نسبت فاصله طی شده به وسیله جبهه حلال است.
از نقایص کروماتوگرافی کاغذی میتوان به مواردی چون لکه‌های چند تایی ، دنباله دار شدن و اثرات لبه یا کناره اشاره کرد. این روش در جداسازی مواد با ماهیت زیستی وسیع ترین کاربرد را داشته و در مسائل کلینیکی و زیست شیمیایی ، جداسازی اسیدهای آمینه و پپتیدها در بررسی ساختارهای پروتئین به کار گرفته میشود. آزمایش روزمره ادرار و سایر مایعات بدن برای اسید آمینه و قند، جداسازی بازهای پورین و نوکلئوتیدها در آزمایش اسیدهای نوکلئیک، جداسازی استرئیدها، تجزیه عمومی، تجزیه بسپارها، تشخیص و ارزیابی فلزات در خاک‌ها و نمونه های زمین شناسی، بررسی ترکیبات فنلی در عصاره های گیاهی، جداسازی آلکالوئیدها و جداسازی ترکیبات علامت‌دار به وسیله رادیو ایزوتوپ‌ها از دیگر کاربردهای کروماتوگرافی کاغذی است، البته توجه داشته باشید که برای جداسازی مواد فرار غیر فعال مانند هیدروکربن‌ها و دیگری جداسازی اسیدهای چرب با فراریت بیشتر این روش مناسب نیست.
کروماتوگرافی ستونی
در کروماتوگرافی ستونی جسم بین فازهاى مایع و جامد پخش میشود. فاز ساکن جسم جامدی است و این جسم اجزای مایعی را که از آن میگذرد به طور انتخابی در سطح خود جذب میکند و آنها را جدا میکند. اثرهایی که باعث جذب سطحی میشوند همان اثرهایی هستند که موجب جذب در مولکولها میشوند. این اثرها عبارتند از: جاذبه الکترواستاتیکی، ایجاد کمپلکس، پیوند هیدروژنی، نیروی واندروالس و غیره. برای جدا کردن یک مخلوط با کروماتوگرافی ستونی، ستون را با جسم جامد فعالی (فاز ساکن) مانند آلومینا یا سیلیکاژل پر میکنند و کمی از نمونه مایع را روی آن میگذارند. نمونه ابتدا در بالای ستون جذب میشود. سپس حلال استخراج کننده ای را در داخل ستون جریان میدهند. این فاز مایع متحرک، اجزای مخلوط را با خود میبرد. ولی به علت نیروی جاذبه انتخابی فاز جامد، اجزای مربوط میتوانند با سرعتهای مختلفی به طرف پایین ستون حرکت کنند. ترکیبی که با نیروی کمتری جذب فاز ساکن شود سریعتر خارج میشود زیرا که درصد مولکولی آن در فاز متحرک از ترکیبی که با نیروی زیادتری جذب فاز ساکن میشود بیشتر است.
اجزای تفکیک شده را میتوان مجددا به دو روش به دست آورد:
1) مواد جامد ستون را میتوان خارج کرد و قسمتی از آنرا که حاوی باند مورد نظر است برید و با حلال مناسب استخراج کرد.
2) چون باندها با زمانهای مختلفی خارج میشوند میتوان آنقدر حلال را از ستون عبور داد تا باندها از انتهای آن خارج شوند و در ظرف جداگانه ای بریزند.
معمولا روش دوم کاربرد بیشتری دارد.
کروماتوگرافی ستون مویین
در این روش که نوعی از کروماتوگرافی گاز- مایع محسوب می شود، لوله مویین بلندی وجود دارد که لایه نازکی از فاز ساکن داخل آن را پوشانده است. قدرت جداسازی ستون‌های مویین پنج برابر ستون‌های معمولی است و زمان جداسازی مواد در این روش کمتر است. همچنین از یک آشکارساز کوچک و حساس و یک تقسیم کننده خطی تشکیل شده تا عواملی چون تغییرات دما، سرعت عبور، اندازه نمونه و نسبت تقسیم تاثیری بر آن نداشته باشد. از آنجا که سرعت خارج شدن اجزای جدا شده بسیار بالا است، آشکارساز باید زمان پاسخ سریعی داشته باشد. البته ثبات‌های معمولی پتانسیل سنجی قادر به همگامی با علائم حاصل از آشکارساز نبوده و باید از دستگاه دیگری مانند یک نوسان کننده اشعه کاتد برای نمایش علائم میتوان استفاده کرد.
