تفاوت یوکاریوت ها و پروکاریوت ها

تفاوت یوکاریوت ها  و پروکاریوت ها عمدتا به ساختار هسته برمی گردد.

پرو: اولیه       یو:واقعی      کاریوم :هسته

یوکاریوت ها هسته ی سازمان یافته و مجزا از سیتوپلاسم دارند اما باکتری ها چیزی مشخصا به اسم هسته ندارند بلکه نوکلئوئید

(شبه هسته ) دارند که توسط غشا، سیتوپلاسم از هسته جدا نشده.

اندامک های سلولی در یوکاریوت ها توسعه یافته اند  اما پروکاریوت ها اندامک ندارند.

باکتری ها

1)     آرکئو باکتری ها :باکتری های باستانی و قدیمی اند و extremophileیعنی شرایطی غیرنرمال که فاکتوری در آن بیش ازاندازه است را دوست دارند مثلا باکتری هایی که در فسیل ها یافت می شوند ،در خلا زندگی می کنند،در دهانه ی اتشفشان که دما زیاد است زندگی می کنند و...   .

2)     یوباکتری ها: باکتری های حقیقی هستند. گروهی پاتوژن هستند و گروهی در محیط زندگی می کنند.

غشا باکتری برای باکتری اهمیت بسیاری دارد. مثلا: روی سطح غشا پروتئین هایی وجود دارد کهsensory transduction  هستند و در لحظه متوجه می شوند که باکتری در چه شرایطی است.

اگر در محیط ماده ی جاذب باشد غشا به فلاژل ها*فرمان می دهد که خاموش باشند (چرخش پادساعتگرد کند) و باکتری در محیط درجا بزند. اگر در محیط ماده دافع باشد(دارای توکسین)، غشا به هسته سیگنال می فرستد که پروتئین هایی بسازد که سم زدایی کنند.  یا به تاژک دستور می دهد ساعتگرد بچرخد و از محیط خارج شود تا دوباره به محیط دارای ماده ی جاذب برسد.

 )****** فلاژل ها: تاژک باکتری است که شکل های مختلفی دارد: چند رشته ای، تک رشته ای، در دو طرف باکتری هرکدام یک رشته (

ژنوم باکتری

باکتری ها ژنومی دارند که تماما در رونویسی به اگزون هستند.

اگزون ها قسمتی از ژنوم هستند که کدون های اسید امینه از روی آن ایجاد می شود.  اینترون ها از رونوشت حذف می‌شوند.

سیستم بیان اوپرانی دارند . پلی پروتئین می سازند سپس پروتئاز ها آنها را از هم جدا کرده و به چند پروتئین جدا تبدیل می کنند.  مثلا اگر قرار است لاکتوز مصرف شود تمام آنزیم های چرخه ی لاکتوز در یکجا از ژنوم تجمع دارد و وقتی پلی پروتئین آن بیان می شود همه انها با هم هستند.

اما در ژنوم یوکاریوت ها توالی های اینترون وجود دارد. و وجود آنها ضروری است.  این توالی ها،اینترون به یه ژن توانایی ایجاد رونوشت هایی با ترتیب متفاوت میدهد زیرا با حذف اینترون اگزون ها میتوانند به ترتیب های متفاوت به هم متصل بشوند که تولید ایزوفرم ها و در نتیجه ایزو آنزیم می کند. آنزیم ها با پایه مشابه و از یک ژن ولی عملکرد متفاوت. این مرحله در پروکاریوت ها وجود ندارد.

ژنوم پروکاریوت ها

در پروکاریوت ها هسته مشخص ندارند .باکتری که  در ژنتیک و بیولوژی مولکولی استفاده میشود اشریشیا ایی کلای است زیرا این باکتری، باکتری است که ژنوم آن کاملا مورد شناسایی قرار گرفته است. در یوکاریوت ها DNA  برای جا شدن در هسته به واسطه هیستون ها فشرده می شود.در پروکاریوت ها هم باید همچین اتفاقی بیوفتد که به آن ابر ماپیچ شدن گفته می شود. اینکه DNA  از دو طرف پیچیده میشوند. ابر مارپیچ(supper coil) شدن توسط توپو ایزومراز ها اتفاق می افتد. . توپوایزومراز ها گروهی پروتئین هایی هستند کهه باعث میشود که ساختار ژنوم باکتری ها تعیین شود. توپوایزومراز 1 و 2و 4 معروف تر اند. به توپوایزومراز 2 در E.coli آنزیم ژیراز گفته میشود.

در هنگام همانند سازی یک توپوایزومراز در جلوی حباب همانند سازی ابر مارپیچ را باز می کند و یک توپوایزومراز پس از انجام همانند سازی بار دیگر ابر مارپیج را می بندد.

بعضی پروتئین ها وجود دارند که شبه هیستون هستند. هم دور DNA میپیچند هم  DNA دور آن ها می پیچد و یک حالت هسته مانند ایجاد می کند که در ای کلای مهم ترین آن ها HMS ,HU1 ,HU2 هستند

بعضی دیگر پروتئین هایی وجود دارند که ساختار را حفظ می کنند که این پروتئین ها بعد از همانند سازی DNA را چک می کنند که در آن تغییری رخ نداده باشد که مهم ترین آن در ای کلای MUK هست.

باکتری ها فقط یک ژنوم حلقوی دارند.

·        تنها باکتری که دوتا ژنوم حلقوی دارد.

·        Agrobacterium tumefaciens: باکتری ای داری هردو ژنوم حلقوی و خطی. در خاک زندگی میکند و در ریشه ی گیاهان باعث بیماری گال میشود.اگر ریشه به هر دلیلی آسیب ببیند این آسیب در سطح ریشه باعث می شود باکتری وارد ریشه شود و ایجاد تومور کند(باکتری تومورزا)

ممکن است این باکتری وارد سلول گیاه شود و یکی از ژنوم خود را درون ژنوم گیاه قرار دهد و ویژگی خاصی به آن بدهد. ممکن است باکتری هنگامی که گیاه را آلوده کرد در تکثیر خودش ژن های از گیاه را بردارد و بعد گیاه بعدی که در آن محل کاشته میشود یا گیاهی کهه در همان نواحی قرار دارد را تغییر دهد و همین اتفاق در گوناگونی گیاهان باعث تکامل شده است. همین ویژگی ابزاری برای مهندسی ژنتیک است. اگر بخواهیم در گیاهی دست ورزی ژنی انجام دهیم  در آزمایشگاه ژن مورد نظرمان را به این باکتری میدهیم و بعد باکتری آن را به گیاه می دهد. (گیاهان transgenic تراریخته)

Plasmid

ِDNAحلقوی دورشته ای supercoil ولی خارج از کروموزوم است.

پلازمید خود جدا از کرموزوم میتواند همانند سازی،رونویسی و پروتئین سازی کند و صفت بخش است یعنی وجودش میتواند باعث وجود یک فنوتیپ باشد.

دارایcopy number  های متفاوت(مثلا در یک باکتری یک ژنوم ولی 10 پلازمید)

ویژگی های ژنتیکی متفاوتی به باکتری می دهد، مثلا بعضی از باکتری ها توانایی انتقال یک صفت مثل مقاومت دربرابر آنتی بیوتیک را دارند. به طور مثال آنزیمی را می سازد که آنتی بیوتیک را تجزیه می کند(پنی سیلیناز،سفالوسپوریناز)

پلازمیدعامل انتقال افقی در باکتری ها( یعنی از یک باکتری به باکتری دیگر که از نسل خودش نیست) همین باعث می شود اگر یک باکتری به یک آنتی بیوتیک مقاوم است می تواند باکتری های دیگر هم مقاوم کند(که باعث انتشار مقاومت آنتی بیوتیکی بین افراد می شود).

سلول های یوکاریوتی به جز مخمر ها پلازمید ندارند. اما قابلیت جذب پلازمید را دارند و می توانند آن را درک کنند. پلازمید ها نمی توانند همان همانند سازی و رونویسی که در باکتری ها داشتند اینجا هم داشته باشند.

پلازمید ابزاری برای ژن درمانی است. می توانیم ژن مورد نظر را روی آن بنشانیم و سپس آن را به داخل سلول بفرستیم. این کار ممکن است باعث رفع نقص ژنتیکی شود. به علت همولوژی که از لحاظ ساختار سیکواِنس و توالی با ژنم دارد می توند وارد کوروموزوم شود و یک homologos recombination اتفاق بیفتد ( نوترکیبی شبیه بهم  مثل کراسینگ اور ) پلازمیدی که بتواند وارد کروموزوم بشود و در آن باقی بماند را اپی زوم می گوییم.

بعضی از پلازمید ها توالی شان شبیه توالی کروموزوم سلولی خاص می باشد اگر ژنی را داخل آن قرار دهیم ممکن است بتواند درون آن قرار گیرد زیرا دو توالی اطراف آن ، شبیه توالی کروموزوم هستند و وقتی وارد میشود ، ژن جدید را هم با خودش می آورد.

در سلول های یوکاریوتی غیر از مخمرها و بعضی سلول ها که توانایی تحمل پلازمید را دارند ، پلازمید به صورت اپی زومال وجود دارد و اگر نتواند وارد ژنوم شود مراحل رونویسی و ترجمه و ... صورت نمی گیرد و سلول توسط آنزیم آندو نوکلئاز آن را حذف می کند .

دو فرم از DNA داریم :

‏١ relaxed : فرم عادیِ دو رشته ای که حلقوی شده

‏٢super coiled : همان حالت عادیست که پیچیده شده

ژنوم باکتری در حالت عادی به صورت CCC می باشد (covalently closed circle), پیوند فسفودی استر حلقه بسته ایجاد کرده است. معیاری به نام linking number داریم که می گوید دو تا حلقه DNA چند بار از روی هم عبور کرده است.

‏ Turn: یک پیچ کامل DNA که  major group و minor ها را دارد .

‏  DNA در حالت عادی به صورت راست گرد است ، اگر چرخش برای تولید ابر مارپیچ در راستای محور خودش باشد ، super coil مثبت و اگر در خلاف جهت باشد super coil منفی است. Z DNA چپ گرد است ، اگر به سمت چپ بچرخد ، Super coil مثبت و اگر به سمت راست بچرخد super coil منفی می شود .

دو فرم از super coil یا ابر مارپیچ داریم :

‏-١toroidal

‏-٢)plectonemic که این ساختار در طبیعت بیشتر مشاهده می شود مخصوصن در باکتری ها (

انرژی DNA در حالت relaxed و super coiled با یکدیگر فرق می کند و این تبدیل احتیاج به انرژی دارد .

توپو ایزومراز نوع ١ آنزیمی ست که برای عملکرد نیاز به انرژی ATP ندارد و روی یک رشته از DNA کار می کند . در پروکاریوت ها روی super coil منفی و در یوکاریوت ها روی super coil مثبت و منفی عمل می کند .این آنزیم DNA را به حالت relaxed تبدیل می کند .

توپو ایزومراز نوع ٢ روی ٢ رشته DNA عمل می کند و با صرف ATP ، باعث ایجاد super coil منفی می شود و همانند توپو ایزومراز نوع ١ ، در پروکاریوت ها روی super coil منفی و در یوکاریوت ها روی super coil مثبت و منفی عمل می کند. بازگشت به حالت relaxed به انرژی احتیاج ندارد .

بسته به مکان روی ژنوم و فاز همانندسازی یا رونویسی Supercoil متفاوت بوده و در نتیجه انرژی نیز متفاوت است.

توپوایزومراز I در DNA حلقوی یک رشته را باز کرده و ساختاری گسسته ایجاد میکند و پشت آن را می‌بندد. به عبارتی حول یک محور می‌پیچاند و سپس می‌بندد.

ساختار پلازمید ساختاری Supercoil بوده و به صورت  Extrachromosomal  در سیتوپلاسم باکتری وجود دارد. همانند سازی و رونویسی ژنوم را عینا انجام میدهد. دارای یک نقطه‌ی آغاز همانندسازی یا Origin of Replication یا oriC است.

پلازمید مهم ترین ابزار در مهندسی ژنتیک برای اضافه کردن یا برداشتن یک ژن از یک ارگانیسم است. به عبارتی ابزاری مهم برای انتقال ژن بین باکتری ها و حتی انتقال به سلول یوکاریوتی است.

بعضی از باکتری‌ها دارای توانایی جذب پلازمید از محیط هستند که به انها Competent Bacteria یا باکتری‌های توانا گفته می شود که این توانایی مربوط غشا سیتوپلاسمی‌ آن‌هاست.

بعضی باکتری‌ها این قابلیت را ندارند و با روش Electroporation جذب برای آن‌ها صورت می‌گیرد. شوک الکتریکی در حد Micro-Second به ساختار غشا سیتوپلاسمی داده می‌شود و Pore Size ها باز شده و پلازمید جذب می‌شود و دوباره بسته می‌شوند.

پروتئین‌های غشا در جاهایی دارای Pore هستند و سیتوپلاسم را با خارج سلول مرتبط می‌کنند. برای مثال انتقال فعال از طریق پروتئین‌ها توسط همین Poreها انجام می‌شود. تغییر اندازه Pore‌ها می‌تواند باعث جذب DNA خارجی شود.

بعضی از باکتری‌ها دارای ساختار لیپوتیئوئیک اسید (ساختار موجود در باکتری‌های گرم مثبت) هستند. این ساختار باعث توانایی جذب پلازمید می‌شود و باکتری را Competent یا توانا می‌کند.

در آزمایشگاه برای باکتری‌هایی که این ویژگی را ندارند با دو روش Plasmid Transfer انجام داده می‌شود:

۱- باکتری با یک سری از مواد شیمیایی treat می‌شود مانند کلرید منیزیم و در شرایط دمایی مختلف (دمای پایین  و بالا) قرار داده می‌شود. تغییرات به وجود اومده در غشا میتواند غشا را مستعد جذب پلازمید کند.

۲-  از روش Electroporation استفاده می‌شود.

F-Plasmid: Fertility Plasmid پلاسمید باروری

در بعضی از باکتری ها وجود دارد و به آن‌ها باکتری Fertility مثبت یا بارور گفته می‌شود. و اگر نداشته باشد Fertility منفی هستند.

F-Plasmid در غشا سیتوپلاسمی باکتری پیلی جنسی می‌سازد. توالی‌ای که روی این پلازمید باعث ساخته شدن پیلی جنسی می‌شود توالی ای است به نام TraD. یکی از کارهای پیلی جنسی چسباندن باکتری ها به هم است. این تماس باعث می‌شود انتقال پلازمید از طریق پیلی جنسی راحت اتفاق بیافتد. به این نوع انتقال Conjugation یا هم‌یوغی گفته می‌شود.  اگر باکتری Fertility منفی باشد نمی‌تواند پلازمید خود را انتقال دهد ولی می‌تواند به پیلی باکتری Fertility مثبت بچسبد و از آن پلاطمید دریافت کنند. حال اگر پلاسمید انتقالی خود F-Plasmid باشد باکتری Fertility منفی تبدیل به Fertility مثبت می‌شود‌.

پلازمیدها انتقال افقی دارند یعنی یک باکتری می تواند به باکتری دیگر صفتی دهد که پلازمید F می تواند همین صفت  باشد. در پلازمید علاوه بر ژن های مربوط به باروری که روی آن قرار می گیرد ژنهای دیگری مانند ژن مقاومت آنتی بیوتیکی،ژن تجزیه کننده تولوئن یا هیدروکربن ها و... نیز موجود هستند. برای مثال در مواقعی که نفت کشی  سوراخ میشود و لکه نفتی بزرگی در دریا ایجاد میشود با استفاده از روش های بیولوژیک هیدروکربن های نفت را به موادی با ویسکوزیته بالا تبدیل میکنند و لکه حالت ژله ای می گیرد و جمع آوری می شود؛ در تشکیل ماست نیز باکتری لاکتو باسیل با تولید پلی ساکارید هایی زنجیره دار به شیر قوام می دهد و ماست تشکیل می شود. در آزمایشگاه با conjugation کار نمی کنیم چون نمی توانیم شبیه سازی کنیم، نهایتاً می توانیم از Electroporation استفاده کنیم پلازمید را کنار باکتری قرار دهیم و سانتریفیوژ کنیم تا پلازمید به غشا باکتری بچسبد سپس با شوک الکتریکی غشا باز شده و پلازمید وارد می شود، البته در صورتی که در روش treat کردن که توضیح داده شد پلازمید وارد باکتری نشد از Electroporation استفاده می شود الکتریسیته باعث بی نظمی غشا و به هم خوردن بار غشا می شود و ترکیبات و پروتئین های داخل غشا را دچار فشار و استرس می کند و بازگشت  هومئوستار سلول به حالت عادی هم زمان بر است و هم واکنش ها را تحت تاثیر قرار می دهد.

هدف اصلی انتقال ژن های( gene of interest )به پلازمید است، مثلا در تولید انسولین ژن سلول های بتا لانگرهانس برداشته می شود و سپس وارد پلازمید و بعد از آن وارد باکتری E.coli می شود. این باکتری به علت عدم نیاز انسولین نمی سازد ،انسولین انسانی مورد نیاز  در پلازمید به علت تولید بالا تامین می شود. به این عمل کلونی یا بیان گفته می شود. این کار در recombinant ها انجام میشود و مورد دیگر  آن در transgenic animal مشاهده می شود. یعنی حیواناتی که با تغییر ژنی ویژگی انسانی داشته باشند؛ مثلا موش های آزمایشگاهی با سیستم ایمنی مانند انسان. برای اینکه یک ژن را به تعداد زیادی کپی و amplify کنیم نیاز به واکنش هایی داریم به نام    PCR(Polymerase Chain Reaction)

پلازمید های امروزی پلازمیدهایی هستند که توالی های آنها بر اساس تصور خودمان تغییر دادیم.

راه دیگر برای انتقال ژن بع باکتری استفاذه از باکتریوفاژ است که با حمله به باکتری DNA خود را به آن انتقال می دهد.

اولین مرحله در مورد عمل کلونی بریدن DNAاز جایگاهی مشخص است، باکتریها دارای آنزیم هایی به نامEndonuclease یا Restriction  enzyme یا آنزیم محدودکننده هستند. در داخل DNA درجایگاه های مشخص پیوند های فسفو دی استر را می برند. این آنزیم ها مکانیسم دفاعی باکتری اند و باعث می شود باکتری هر توالی و پلازمیدی نپذیرد؛ برای مثال این آنزیم ها در برابر باکتریوفاژ از خود دفاع می کنند، و در واقع DNA بیگانه را شناسایی می کنند. در مهندسی ژنتیک هم پلازمید و هم میزبان مهندسی می شود و قبل از فرستادن ژن خارجی به داخل باکتری ابتدا ژن آنزیم محدود کننده را خاموش می کنیم تا باکتری تحت هر شرایطی آن را بپذیرد.

در مهندسی ژنتیک ما میزبان(host) که پلاسمید رامی پذیرد و خود پلاسمید را مهندسی می کنیم و ژن های علیه پلازمید را در میزبان خاموش می کنیم.

آنزیم های Restriction انواع مختلفی دارند و می توانند توالی های خاصی را شناسایی کنند و پیوند های هیدروژنی و فسفودی استر آن توالی ها را بشکنند.

انواع آنزیم های Restriction: ١. پس از برش قسمت هایی به نام انتهای چسبنده (sticky end) ایجاد می کنند که به صورت over hang (آویزان) باقی می مانند

٢.انتهای چسبنده ایجاد نمی کنند و over hang ندارد و انتهای بسته ایجاد می کنند مانند آنزیم ECOR5.

اگر ما ژنی که می خواهیم استفاده کنیم در ابتدا و انتهایش یک سری توالی مورد نظر خودمان را قرار دهیم (این توالی ها،توالی هایی هستند که ما دستی مورد شناسایی آنزیم Restriction قرار دادیم)وقتی ژن ساخته شد دو طرفش توالی مورد نظر ما است و وسط توالی ژن است حالا اگر با آنزیم Restriction دو طرف را ببریم دو تا over hang ایجاد می شود. اگر پلازمید را هم با همان آنزیم ببریم over hang های پلازمید با over hang های ژن ما با هم مکمل هستند و توالی DNA ما می تواند وارد پلازمید شود و حالا یک پلازمید recombinant داریم(این پلاسمید ، پلاسمیدی است که ژن مورد نظر ما را در داخل خودش دارد)

انواع carrier ها :

1) پلازمید : تا kilo base pair ١٠ می توانیم به پلازمید ژن بدهیم اگر بیشتر باشد پلازمید زمان انتقال می شکند.

2) باکتریوفاژ : تا kilo base pair ٢٤ می تواند ژن بیگانه را بگیرد و با خودش به داخل باکتری منتقل کند.

باکتریوفاژ ها دو دسته اند:

١.همانند ویروس های یوکاریوتی عمل می کنند(یک سلول را آلوده می کند و در سلول همانندسازی می کند و تکثیر می شود سپس بیرون می رود)

٢. توالی مشابه خود را در ژنوم باکتری پیدا می کند و در آن قسمت می نشیند که به این نوع پروفاژ می گویند.

مکانیسمی که باکتریوفاژ یک ژن جدید را داخل باکتری قرار می دهد Transduction نام دارد.

مکانیسمی که به صورت عادی یک سلول compatant پلازمید را از محیط برمی دارد Transformation نام دارد و در طبیعت conjugation (هم یوغی)را برای نقل و انتقال ساختار پلاسمیدی بین باکتری ها داریم.

3)  کروموزوم های مصنوعی باکتری که خودمان ساختیم(BACs):کاربرد در مطالعات ژنتیکی

از kilo base pair ١٠٠ به بالا ژن را در داخل خود می تواند تحمل کند.

٤. کروموزوم های مصنوعی مخمری( YACs ): میزبانش یوکاریوتی است

و تا kilo base pair ٣٠٠ ژن را می تواند در خود قرار دهد.

در پلازمید سکانس هایی وجود دارد که وسط این سکانس ها ژنی به نام مقاومت به تتراسایکلین و در طرف مقابل هم ژنی به نام مقاومت به آمپی سیلین وجود دارد. در بین این توالی ها ، توالی های برش آنزیمی قرار دارد. در وسط ژن آمپی‌سیلین یک PSD وجود دارد که باعث میشود ژن از وسط برش پیدا کند و ٢ تا overhang ایجاد بشود. سپس ژن مورد نظر در مجاورت پلازمید قرار داده میشود و پلازمید ژن را دریافت کرده و این کار باعث می‌شود که پلازمید ژن آمپی سیلین خود را از دست بدهد. به این پلازمید جدید recombinant میگویند.

این ژن مقاومت به آنتی بیوتیک در پلازمید قرار داده می شود تا به وسیله آن باکتری قابل شناسایی باشد یعنی باکتری های مقاوم به تتراسایکلین باکتری هایی هستند که پلازمید را دریافت کرده اند. برای شناسایی در محیط کشت باکتری ابتدا تتراسایکلین اضافه میشود اگر باکتری رشد کرد معلوم میشود که پلازمید را دریافت کرده است.

علت استفاده از آمپی سیلین این است که هنگام برش پلازمید احتمال دارد بدون این که ژن مورد نظر وارد پلازمید شود، قسمت های overhang به هم متصل شوند و همان پلازمید اولیه به دست بیاید. برای شناسایی اینکه ژن مورد نظر وجود دارد یا نه ؛ بعد از مدتی که یک کلونی باکتری در محیط حاوی تتراسایکلین رشد کرد، یک کاغذ میکروسلولز بر روی plate کذاشته میشود تا بعد از رشد کلنی ها روی کاغذ، آن را روی محیط حاوی آمپی سیلین قرار داده شود(در واقع می گوییم plate را print کرده ایم) .اگر باکتری رشد نکرد یعنی حاوی ژن مورد نظر است ولی اگر رشد کرد یعنی حاوی پلازمید أولیه است که ژن مقاوم به آمپی سیلین را دارد. به این کار cloning میگویند.
‎ Transfection یعنی ورود یک ژن بیگانه در یک ساختار پلازمیدی یا هر ساختار دیگر به سلول یوکاریوتی .(سلول های یوکاریوتی به غیر از مخمر ها پلازمید ندارند.) برای ژن درمانی آدنو ویروس ها بهترین carrier هستند.

بعد از تولید پلازمید باید تمهیداتی انجام بشود تا پلازمید بیان بشود. پس باید توالی promotor قرار داده بشود تا از روی ژن رونوسی انجام بشود. یا توالی «شاندارگارمون» که باعث میشود ساختار به ریبوزوم بچسبد. 
برای شناسایی پروتئینی که مورد نظر است، یک توالی که چند کدون اسیدآمینه هیستیدین دارد مورد استفاده قرار میگیرد. یعنی ابتدای پروتئین جدید ٦ آمینواسید هیستیدین وجود دارد بعد خود پروتئین شروع میشود که به این برچسب گذاری میگویند (N-terminal tag)در این مثال از ستون‌های نیکل استفاده و درون آن رزین ریخته میشود که با نیکل جفت شده است. نیکل نسبت به .hys تمایل دارد. به این ترتیب اگر مجموعۀ پروتئین‌های سلولی را از این ستون عبور دهیم، پروتئین‌های نوترکیب به دلیل داشتن 6 hys.  پشت سر هم، تمایل زیادی به چسبیدن به نیکل دارند و باقی پروتئین‌ها رد می شوند. سپس با شست و شوی ستون با ایمیدازول، پروتئین های باقیمانده (نوترکیب) از ستون جدا میشوند. (به دلیل اینکه تمایل نیکل به ایمیدازول بیش از تمایل نیکل به هیستیدین است.) گاهی در ژن، protease cleavage هم گذاشته می‌شود چون توالی نشانه (tag)  در عملکرد پروتئین موردنظر می تواند اختلال ایجاد میکند و در نتیجه کارایی مورد نظر را نخواهد داشت.

 پس این توالی در ژن گذاشته میشود تا پس از تخلیص، توالی نشانه از پروتئین حاصل بریده شود و پروتئین طبیعی باقی بماند. پس از این توالی ها، باید یک توالی در ژن تعبیه شود که محل عملکرد آنزیم محدودکننده باشد تا ژن مورد نظر بتواند به پلازمید متصل شود. (Multiple Cloning Site)

این مجموعه به طور کلی یک پلاسمید بیانی گفته میشود؛ یعنی علاوه بر انتقال به درون سلول، قابلیت بیان را هم دارد.

هدف کلی در مهندسی ژنتیک، تولید انبوه است. پس راه انداز (promotor) را بسیار فعال انتخاب کنیم تا بیان ژن موردنظر بسیار زیاد صورت بگیرد.

گیاهان تراژنی

باکتری Agrobacterium tumefaciens دارای پلاسمید Ti (Tumor inducing plasmid)  است که میتواند سلولهای گیاهی را آلوده و در ریشۀ گیاه تومور ایجاد کند. در این پلاسمید، قسمتی به نام  TDNA هست که توالی مشابه ژنوم گیاهی است. پس T-DNA در ژنوم گیاه مینشیند. به این ترتیب اگر در وسط آن ژن موردنظ را تعبیه کنیم، در واقع توالی موردنظر در ژنوم گیاه جای میگیرد و صفت موردنظر بیان میشود.

کاربرد در داروسازی: دارویی به نام taxol که در درمان ovarian cancer، cervical cancer و breast cancer  کاربرد دارد، تنها در یک نوع درخت تولید میشود و با وجود تلاشهای فراوان محققان تا به حال نتوانسته اند آن را به طور مصنوعی سنتز کنند. بهترین حالت برای تولید انبوه، استفاده از گیاه تراژنی است به طوری که ژن سازندۀ این ماده را با پلاسمید Ti  وارد سلول گیاهی کنیم و به صورت گسترده آن را تولید کنیم.

 

این مطلب اختصاصن توسط وب سایت بیولایف تهیه و تالیف شده و تنها با ذکر منبع و قرار دادن لینک مجاز به ، اشتراک گذاری هستید.

هموطن گرامی جهت بهبود در سلامت عمومی و ارائه خدمات در داروخانه ها پرسشنامه ای طراحی شده است.

 برای پر کردن آن لطفا کلیک کنید.